Gram módszer

Az oldal jelenlegi verzióját még nem ellenőrizték tapasztalt közreműködők, és jelentősen eltérhet a 2019. július 16-án felülvizsgált verziótól ; az ellenőrzések 5 szerkesztést igényelnek .

A Gram  -módszer a mikroorganizmusok kutatási célú festési módszere, amely lehetővé teszi a baktériumok sejtfaluk biokémiai tulajdonságai alapján történő megkülönböztetését . Hans Christian Gram dán orvos javasolta 1884 - ben .

Gram szerint a baktériumokat anilinfestékkel  - encián vagy metilibolya stb. - festik meg, majd a festéket jódoldattal rögzítik . A festett készítmény ezt követő alkoholos mosása után azokat a baktériumokat, amelyek határozottan kék színűek és vastag sejtfallal rendelkeznek, Gram -pozitív baktériumoknak nevezzük, Gram (+) jelöléssel , - ellentétben a gram-negatív (vékony ) baktériumokkal. sejtfal), Gram (-) , amely mosáskor elszíneződött.

Oldószeres öblítés után a Gram-festék kontrasztos vörös festéket ad, amely minden Gram-negatív baktériumot vörösre vagy rózsaszínre fest. Ennek oka egy külső membrán jelenléte, amely megakadályozza a festék behatolását a sejtbe. A teszt a baktériumokat sejtfaluk szerkezete alapján két csoportba sorolja.

Használata a diagnosztikában

A Gram-festés nagy jelentőséggel bír a baktériumok taxonómiájában, valamint a fertőző betegségek mikrobiológiai diagnosztikájában.

Gram-pozitív kókusz (kivéve a Neisseria nemzetség képviselőit ) és spórás (a Coxiella burnetii kivételével ) baktériumformák, kék-fekete ( sötétkék ) színűek .

Sok nem spórát hordozó baktérium Gram-negatív , és vörösre vagy rózsaszínre festődik.

Festési technika

A Gram-festés egy összetett festési módszerre utal, amikor egy kenetet két színezéknek tesznek ki, amelyek közül az egyik a fő, a másik pedig egy további festék. A színezékeken kívül fehérítőszereket is használnak összetett színezési módszerekhez: alkohol, savak stb.

Gram-festéshez gyakrabban használják a trifenil-metán csoportba tartozó anilin festékeket : encián, metilibolya vagy kristályibolya . A Gram-pozitív mikroorganizmusok erős kapcsolatot adnak a jelzett színezékekkel és jóddal. Ugyanakkor alkoholnak kitéve nem színeződnek el, aminek eredményeként további fukszinnal történő festéssel a gram-pozitív mikroorganizmusok nem változtatják meg az eredetileg elfogadott lila színt.

A Gram-negatív mikroorganizmusok olyan vegyületet képeznek, amelyet az alkohol bázikus színezékekkel és jóddal könnyen elpusztít . Ennek eredményeként a mikrobák elszíneződnek, majd bíborvörösre festődnek, és pirosra válnak.

Anyag előkészítése festéshez

  1. A vizsgálandó anyagot vékony rétegben eloszlatjuk egy jól zsírtalanított tárgylemez felületén.
  2. Az elkészített kenetet levegőn szárítjuk, és a teljes száradás után rögzítjük.
  3. A szövettani metszeteket standard módszerrel készítjük, a szövetdarabokat formalinban rögzítjük és paraffinba öntjük.

Javítás

Rögzítéskor a kenetet a tárgylemez felületére rögzítik, ezért a készítmény későbbi festése során a mikrobasejtek nem mosódnak le. Ráadásul az elölt mikrobasejtek jobban festődnek, mint az élők.

Megkülönböztetik a fizikai rögzítési módszert, amely a magas hőmérsékletnek a mikrobiális sejtre gyakorolt ​​hatásán alapul, és a kémiai módszerek között, amelyek során olyan vegyi anyagokat használnak, amelyek a citoplazmafehérjék koagulációját okozzák.

A rögzítés fizikai módja

A készítménnyel ellátott tárgylemezt csipesszel vagy a jobb kéz I-es és II-es ujjával a bordáknál fogva felfelé húzva, sima mozdulattal 2-3-szor az égőláng felső része fölött veszik. A teljes rögzítési folyamat nem tarthat tovább 2 másodpercnél.

A rögzítés megbízhatóságát a következő módszerrel ellenőrizzük: az üveglemez kenettől mentes felületét a bal kéz hátsó felületére visszük fel. A kenet megfelelő rögzítésével az üvegnek forrónak kell lennie, de nem okozhat égési érzést (70-80 ° C).

A rögzítés kémiai módszere

A kenetek rögzítésére metil-alkohol , aceton , Nikiforov keveréke ( 96% etil-alkohol és érzéstelenítő észter keveréke 1:1 arányban), Carnoy folyadék (96% etil-alkohol - 60%, kloroform  - 30%, jégecet sav  - 10%)), alkohol-formol (40% formalin  - 5 ml, 96% etil-alkohol - 95 ml). A megszárított kenetet tartalmazó tárgylemezt 10-15 percre fixálószeres palackba merítjük, majd levegőn szárítjuk. 40%-os formalin páros rögzítését is alkalmazzák néhány másodpercig.

A kenetek festésének folyamata

  1. Az egyik fő festéket egy fix kenetre öntjük 2-3 percig. A csapadék elkerülése érdekében szűrőpapíron kell megfesteni.
  2. Engedje le a festéket, óvatosan távolítsa el a szűrőpapírt. A kenetet Lugol-oldattal vagy Gram-jodid-oldattal (kálium-jodid és kristályos jód 2:1 arányú vizes oldata) töltjük 1-2 percig, amíg a készítmény megfeketedik.
  3. Az oldatot lecsepegtetjük, a kenetet 96°-os etil-alkohollal vagy acetonnal öblítjük , felöntjük és lecsepegtetjük, amíg a kenet elszíneződik és a folyó folyadék átlátszóvá nem válik (kb. 20-40-60 másodperc).
  4. A tárgylemezeket alaposan megmossuk folyó vagy desztillált vízben 1-2 percig.
  5. A baktériumok gram-negatív csoportjának azonosítása érdekében a készítményeket fukszinnal vagy szafraninnal festik (2-5 perc).
  6. Öblítse le folyó vízben, és szárítsa meg szűrőpapírral.

Gram- Weigert festési technika baktériumokra szövettani metszetekben

  1. A paraffinmentesített metszeteket vízbe hozzuk.
  2. 20 percig festjük 1%-os pararosanilin vagy bázikus fukszin 1%-os ecetsavas oldatában (a festékoldatot forrásig melegítjük, lehűtjük és szűrjük).
  3. 3 csere desztillált vízben mosva.
  4. 5 percig festjük 1%-os kristályibolya desztillált vízben.
  5. Gyorsan öblítse le 1%-os nátrium-klorid oldattal.
  6. Kezelve 30 másodpercig keverékben: 1 rész jód + 2 rész kálium-jodid + 100 rész desztillált víz.
  7. Nedvesítse szűrőpapírral.
  8. A különbségtétel egyenlő térfogatú anilin és xilol keverékének (1-2 ml) felvitelével a vágásra; az oldatokat addig ürítjük, amíg a festékfelhők el nem távolodnak a vágástól.
  9. Végezzen 3 xilolcserét.
  10. Balzsamba vagy bármilyen xilolban oldott gyantába zárva.

Eredmény: A Gram-pozitív baktériumok kék-feketék, a fibrin lila, a sejtmagok vörösek.

Lásd még

Irodalom

Németül
  • Gram, HCÜber die isolierte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten  (német)  // Fortschritte der Medizin: magazin. - 1884. - Bd. 2 . - S. 185-189 .
Angolul
  • Bergey, David H.; John G. Holt; Noel R. Krieg; Peter HA Sneath. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology  (angol) . – 9. kiadás – Lippincott Williams & Wilkins, 1994.
  • Madigan, M. T.; Martinko J; Parker J. Brock Mikroorganizmusok biológiája  (határozatlan idejű) . — 10. kiadás. Lippincott Williams & Wilkins, 2004.
  • Ryan, KJ; Ray, C.G. Sherris Medical Microbiology  (határozatlan idejű) . - 4. kiadás - McGraw Hill, 2004.
  • A foltok alkalmazása a klinikai mikrobiológiában // Biotechnic & Histochemistry, 76. kötet, 3. szám, 2001. május 1., pp. 119-125 (7)
  Ugrás a Wikidata elemre  Szótárak és enciklopédiák