Beágyazott polimeráz láncreakció

A beágyazott polimeráz láncreakció ( angolul  nested PCR - „nested” PCR) a PCR  kétlépcsős változata , amelyet a nem specifikus reakciótermékek mennyiségének csökkentésére használnak [1] . Az első szakaszban egy régiót amplifikálnak , amely tartalmazza a cél DNS- fragmenst és annak szegélyező szekvenciáit (vagyis a fragmens szélein található), amelyhez az első primerpárt csatolják . A második lépésben olyan primereket adunk hozzá, amelyek komplementereka cél fragmentum végei. Mivel az első szakasz terméke tartalmazza a célfragmenst (vagyis az első szakasz termékén belüli végterméket), ezt a PCR-variációt beágyazottnak nevezzük [1] .

Polimeráz láncreakció

A polimeráz láncreakció (PCR) egy DNS-amplifikációs folyamat, amely a DNS-függő DNS-polimeráz enzimet alkalmazza . Az ilyen reakciót széles körben alkalmazzák a genetikai laboratóriumokban a DNS vagy RNS egy bizonyos szakaszának jelenlétének kimutatására a mintákban (a második esetben először az RNS-t DNS-vé kell átalakítani reverz transzkripciós reakcióval ). A PCR-t a génsebészetben is használják a szükséges fragmentum előállítására, és további felhasználására klónozásban , in vitro transzkripcióban és egyéb célokra. A reakció elkészítésének fontos lépése a célfragmens végein összekapcsolandó primerek kiválasztása. Ebben az esetben a primerek gyakran más DNS-régiókhoz is kapcsolódnak, ami a termékek keverékét eredményezi. Ennek valószínűsége a PCR-ciklusok számával nő [1] .

Alapozók

A Nested PCR két pár primert használ, amelyeket két egymást követő reakciólépésben adnak hozzá. Az első párt külsőnek nevezik, és a hely kezdeti amplifikációjára szolgál, amely magában foglalja a cél DNS-fragmenst, míg ebben a szakaszban kis számú hőmérsékleti ciklust (15-30) használnak. A második, belsőnek nevezett párt az első termékéhez lágyítják, és a PCR második szakaszában használják nagyszámú hőmérsékleti ciklussal. Mivel a célfragmentumot tartalmazó DNS mennyisége az első lépés után exponenciálisan növekszik , és az egyes lépésekben használt primerek komplementerek a cél-DNS-régió körüli különböző szekvenciákkal, a reakció eredő specifitása nő. Ezt a megközelítést gyakran használják ritka fragmentumok vagy alacsony komplexitású régiók (például GC-ben gazdag szekvenciák) előállítására [2] .

Reakciólépések és protokoll

A beágyazott PCR protokollt először 1993-ban írták le Kamolvarin és munkatársai veszettség diagnosztizálására [3] . Azóta a műveletek sorrendje gyakorlatilag változatlan [4] . A cikk eredeti protokollját az alábbiakban ismertetjük.

Első szakasz

Az RNS izolálása után reverz transzkripciót végeztünk 50 pmol külső primerpárból 1 μg anyaghoz. Az RNS/ cDNS fúziót és a primereket tartalmazó keveréket ezután 1,25 U-t tartalmazó PCR-pufferrel 50 µl-re feltöltöttük. Taq-DNS polimeráz és 62,5 µmol/l dDNP ( dezoxiribonukleozid-trifoszfát ). 50 µl ásványolajat rétegeztek a keverék tetejére, és 30 PCR-ciklust hajtottunk végre (94 °C, 1 perc (olvadás); 45 °C, 2 perc (hevítés); 72 °C, 2,5 perc (megnyúlás)) [ 3] .

Az első lépésben a cél-DNS-fragmentum körüli régiókkal komplementer primerek külső párját használjuk a fragmens amplifikálására. A célhelyen kívül a primerek más helyekhez is kapcsolódhatnak. Az első szakasz termékeinek végső keveréke mind a cél DNS-t, mind a szennyeződéseket tartalmazza [3] .

Második szakasz

A beágyazott PCR második szakaszához 2 µl-es alikvot részt vettünk az első keverékből, és hozzáadtunk 23 µl olyan keverékhez, amely 20 pmol belső primert tartalmazott, amely komplementer magának a célfragmensnek a régióival, 25 mmol/l dDNF-et, és 1 egység Taq DNS polimeráz. 30 erősítési ciklust töltöttem ugyanazzal a programmal, mint az első szakaszban [3] .

Ebben az esetben rendkívül kicsi annak a valószínűsége, hogy a primer összekapcsolódik az első szakasz más termékeivel, és a legtöbb esetben csak a cél DNS-fragmens amplifikálódik [2] [3] .

Használati példák

A beágyazott PCR-t széles körben alkalmazzák nagy specificitást igénylő feladatokban, mint például: tesztrendszerek [5] , kis mennyiségű anyaggal végzett munka [6] , DNS-minták tisztítása további elemzéshez és felhasználáshoz [7] .

A beágyazott PCR speciális felhasználási esetei:

Jegyzetek

  1. ↑ 1 2 3 Shen Chang-Hui. Nukleinsavak amplifikációja  (angol)  // Diagnosztikai molekuláris biológia. - 2019. - P. 215-247 . — ISBN 9780128028230 . - doi : 10.1016/B978-0-12-802823-0.00009-2 .
  2. ↑ 1 2 Haff L A. Javított kvantitatív PCR beágyazott primerek használatával.  (angol)  // Genom Research. - 1994. - június 1. ( 3. köt . 6. sz .). - P. 332-337 . — ISSN 1088-9051 . - doi : 10.1101/gr.3.6.332 .
  3. ↑ 1 2 3 4 5 Kamolvarin N. , Tirawatnpong T. , Rattanasiwamoke R. , Tirawatnpong S. , Panpanich T. , Hemachudha T. Veszettség diagnosztizálása polimeráz láncreakcióval Nested Primerekkel  //  Journal of Infectious Diseases. - 1993. - január 1. ( 167. évf. , 1. sz.). - P. 207-210 . — ISSN 0022-1899 . - doi : 10.1093/infdis/167.1.207 .
  4. ↑ Pelt-Verkuil, Elizabeth van, 1951-. A PCR amplifikáció elvei és technikai vonatkozásai . - [Dordrecht]: Springer, 2008. - 1 online forrás (325 oldal) p. - ISBN 978-1-4020-6241-4 , 1-4020-6241-9 , 978-1-4020-6240-7 281-24237-2.
  5. ↑ 1 2 Sun Yajuan , Chen Jiajun , Li Jia , Xu Yawei , Jin Hui , Xu Na , Yin Rui , Hu Guohua . Egycsöves egymásba ágyazott PCR-en és egy laterális áramlási csíkon alapuló új megközelítés a tuberkulózisos meningitis rendkívül érzékeny diagnosztizálására  //  PLOS ONE. - 2017. - október 30. ( 12. évf. , 10. sz.). — P.e0186985 . — ISSN 1932-6203 . - doi : 10.1371/journal.pone.0186985 .
  6. ↑ 1 2 Gallego Sandra , Mangano Andrea , Gastaldello René , Sen Luisa , Medeot Silvia. A Nested-polimeráz láncreakció hasznossága az I/II típusú humán T-sejtes limfotróp vírus molekuláris diagnosztizálására  //  Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. - 2004. - június ( 99. évf. , 4. sz.). - P. 377-380 . — ISSN 0074-0276 . - doi : 10.1590/S0074-02762004000400006 .
  7. ↑ 1 2 Mamedov Ilgar Z. , Britanova Olga V. , Zvyagin Ivan V. , Turchaninova Maria A. , Bolotin Dmitriy A. , Putintseva Jekaterina V. , Lebedev Yuriy B. , Chudakov Dmitriy M. Preparing Unbased T-Cell Receptor and Antibody Receptor and Antibody cDNS-könyvtárak a Deep Next Generation Sequencing Profiling számára  //  Frontiers in Immunology. - 2013. - Kt. 4 . — ISSN 1664-3224 . - doi : 10.3389/fimmu.2013.00456 .
  8. ↑ Llop Pablo , Bonaterra Anna , Peñalver Javier , López María M. Nagyon érzékeny egymásba ágyazott PCR eljárás kidolgozása egyetlen zárt cső segítségével az Erwinia amylovorain tünetmentes növényi anyag kimutatására  //  Alkalmazott és környezeti mikrobiológia. - 2000. - május 1. ( 66. évf. , 5. sz.). - P. 2071-2078 . — ISSN 1098-5336 . - doi : 10.1128/AEM.66.5.2071-2078.2000 .
  9. ↑ Yang Xue , Hameed Uzma , Zhang Ai-Fang , Zang Hao-Yu , Gu Chun-Yan , Chen Yu , Xu Yi-Liu. Ned-PCR vizsgálat kifejlesztése a Pilidiella granati gyors kimutatására gránátalma gyümölcsben  //  Tudományos jelentések. - 2017. - január 20. ( 7. évf . 1. sz .). — ISSN 2045-2322 . - doi : 10.1038/srep40954 .
  10. ↑ Guo Ping , Yu Yongxin , Pan Yingjie , Yan Shuling , Wang Yongjie. Nested PCR primerek tervezése és értékelése az I. genocsoportú norovírusok specifikus kimutatására osztrigában  //  Molecular and Cellular Probes. - 2018. - augusztus ( 40. köt. ). - P. 40-43 . — ISSN 0890-8508 . - doi : 10.1016/j.mcp.2018.06.002 .
  11. ↑ Lin Chao , Ying Furong , Lai Yanan , Li Xiaolong , Xue Xiangyang , Zhou Tieli , Hu Dongwei. Beágyazott PCR használata trichomonádok kimutatására bronchoalveoláris mosófolyadékban  (angol)  // BMC Infectious Diseases. - 2019. - június 10. ( 19. évf. , 1. sz.). — ISSN 1471-2334 . - doi : 10.1186/s12879-019-4118-9 .
  Ugrás a Wikidata elemre  Szótárak és enciklopédiák