DNS marker

A DNS-markerek (DNS-markerek) vagy molekuláris genetikai markerek olyan polimorf tulajdonságok, amelyeket molekuláris biológiai módszerekkel detektálnak a DNS nukleotidszekvencia szintjén egy adott génre vagy a kromoszóma bármely más részére , amikor különböző egyedek , fajták genotípusait hasonlítjuk össze. , fajták, vonalak.

Az elmúlt években rengeteg adat halmozódott fel a molekuláris genetikai markerek felhasználásának hatékonyságáról mind a fehérjék, mind a DNS , RNS szintjén, számos genetikai, tenyésztési, biodiverzitás-megőrzési probléma megoldására, az evolúciós mechanizmusok tanulmányozására, kromoszómatérképezéshez, valamint magtermeléshez és nemesítéshez.

A legszélesebb körben használt molekuláris genetikai markerek feltételesen a következő típusokra oszthatók: a fehérjék aminosavszekvenciáját kódoló szerkezeti gének szakaszainak markerei (a fehérjék elektroforetikus változatai ), a szerkezeti gének nem kódoló szakaszainak markerei és a különböző DNS-ek markerei szekvenciák, amelyeknek a szerkezeti génekhez való viszonya általában nem ismert - rövid ismétlődések eloszlása ​​a genomban ( RAPD  - véletlenszerűen amplifikált polimorf DNS; ISSR  - fordított ismétlődések; AFLP  - restrikciós hely polimorfizmus ) és mikroszatellita lókuszok ( tandem ismétlődések elemi egységgel 2-6 nukleotid hosszúságú).

Számos modern technológia létezik a DNS-szintű polimorfizmus kimutatására, amelyek közül a következők különböztethetők meg:

• restrikciós DNS fragmens hossz polimorfizmus elemzés (RFLP);
• polimorfizmus elemzés polimeráz láncreakcióval (PCR) és más , a genomi DNS ismétlődő szekvenciái közötti DNS-amplifikáción alapuló módszerekkel .

Markerek DNS-próbák alapján

• RFLP (RFLP markerek, a restrikciós fragmentumhossz polimorfizmusból ). A restrikciós DNS-fragmensek hosszának polimorfizmusának értékelése többféleképpen is elvégezhető, de a leghagyományosabb módszer a blot hibridizáció) [1] . Ez a módszer magában foglalja a DNS izolálását, restrikciós fragmensek kinyerését, elektroforetikus elválasztását, szűrőkre való átvitelét, majd specifikus DNS-próbák hibridizálását a kapott DNS-fragmensekkel. A DNS-próba klónozott DNS viszonylag rövid szekvenciája, amely bizonyos szintű homológiát mutat, és képes hibridizálni a genomi DNS megfelelő régiójával. A restrikciós enzimek és próbák kombinációi az egyes egyedekre specifikus DNS-fragmensek nagymértékben reprodukálható polimorf spektrumát adják. Az utóbbiak közötti különbségek oka lehet például a restrikciós helyet megváltoztató mutációk. Az RFLP-nek számos fontos előnye van, beleértve a spektrumok nagy reprodukálhatóságát a különböző laboratóriumokban, a marker kodomináns "viselkedését". Az RFLP hatékony a genomtérképezésben, számos biológiai és gazdasági szempontból fontos tulajdonság gének megjelölésével.
• A VNTR ( angol  Variable Number Tandem Repeat ) egy DNS-ujjlenyomatnak ("ujjlenyomatoknak") nevezett módszer [2] . A tandem ismétlődések széles körben elterjedtek a különböző genomokban, és erősen polimorfak. Ezen DNS-régiók nagy variabilitásának eredményeként a mikro- és miniszatellit szekvenciák próbáival végzett RFLP-analízis lehetővé teszi, hogy populációs szinten nagy felbontású multilókusz-spektrumokat kapjunk. A nagyon magas polimorfizmus miatt ez a megközelítés jelenleg jó eszköz az intra- és interpopulációs variabilitás elemzésére, valamint az élőlénycsoportok közötti genetikai távolságok meghatározására. A VNTR allélváltozatok kodominánsan öröklődnek.

PCR markerek

A polimeráz láncreakció (PCR) módszere specifikus primerek felhasználásával és a genomiális DNS egyes szakaszaiból különálló DNS-amplifikációs termékek előállításával jár. Számos kapcsolódó technológia épül erre az elvre. A legszélesebb körben alkalmazott RAPD technológia amplifikált polimorf DNS-fragmensek elemzésén alapul, egyedi primerek segítségével, tetszőleges nukleotidszekvenciával [3] , [4] , [5] .

• SSR ( angolul  Simple Sequence Repeats ) – a rövid mini- vagy mikroszatellit ismétlődést szegélyező primerekkel a PCR lehetővé teszi a kodomináns öröklődésű markerek azonosítását, és ennek megfelelően alkalmas egy adott lókusz heterozigótáinak azonosítására. Egy pár PCR flank primer azonban csak egy lokusz polimorfizmust tesz lehetővé. Sok mikroszatellit lókusz esetében nem lehet polimorfizmust kimutatni. Általános szabály, hogy egy adott mikroszatellit lókusz határoló szekvenciái fajspecifikusak.
• A RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA ) egy  polimeráz láncreakció, amely egyetlen rövid (általában 10 tagú) primert használ, tetszőleges nukleotid szekvenciával [6] , [7] . A primer szekvencia nem teljesen önkényes, hanem a GC összetétel 40-70%-os értéke és a nukleotidszekvencia 50-100%-os nyelvi összetettsége korlátozza. A RAPD-ben egyetlen primer vagy több RAPD primer is használható. A RAPD-terméket az alkalmazott primer fordított szekvenciájával határolt genomiális DNS-fragmens amplifikálásával állítjuk elő. A módszer univerzális különböző fajok vizsgálatára, ugyanazon primerek felhasználásával. Általában az egyik fajban nagy polimorfizmust mutató primer más fajokban is hatásos.
• Az ISSR ( Inter Simple Sequence Repeats ) [8] [9] a   RAPD módszer speciális változata, amelyben a primer egy mikroszatellit szekvenciából áll. Ez a módszer a RAPD-hez hasonlóan egy vagy több 15-24 nukleotid hosszúságú primert használ. De ebben az esetben a primerek tandem rövid, 2-4 nukleotidból álló ismétlődésekből állnak, például 5' -CA CA CA CA CA CA CA CA CA G , és egy vagy két szelektív nukleotidból a primer 3' végén. Az ISSR amplifikációs termékek egy fordított mikroszatellit primer szekvenciát tartalmaznak az oldalakon. Mivel ennél a módszernél a primer szekvencia specifikus és szigorúbban szelektált, mint a RAPD esetében, a PCR annealing magasabb hőmérsékleten (55-60°C) végezhető, mint a RAPD módszernél, így az ujjlenyomat általában jobban reprodukálható.
• Az AFLP ( amplified Fragment Length Polymorphism ) [10]  egy olyan technológia, amely az RFLP és a PCR módszerek kombinációja .  Az AFLP egy összetett módszer, amely több lépésből áll: a genomi DNS-t egyidejűleg két restrikciós endonukleáz ( EcoRI és MseI ) korlátozza, amelyek 4, illetve 6 bázist ismernek fel, így a 3'-végeken túlnyúló fragmensek keletkeznek. A restrikciós genomiális DNS-t ezután egy adapterhez ligáljuk, amely restrikciós helyek ( EcoRI és Msel ) számára "ragadós" végeket tartalmaz. Ezt követően két egymást követő PCR-t végzünk. Az első PCR (előamplifikáció) olyan primereket használ, amelyek teljesen komplementerek az EcoRI és MseI adapterekkel . Az első PCR után nagyszámú amplifikációs termék képződik az EcoRI és MseI adapterek között, amelyeket elektroforézissel nehéz megkülönböztetni. Ezért a második PCR-ben az EcoRI és MseI adapterekkel rendelkező primerek a 3'-végen további és nem komplementer adaptereket tartalmaznak 1-3 bázis között a szelektív amplifikáció érdekében. A DNS-fragmensek szétválasztása poliakrilamid gélben történik, radioaktív, illetve fluoreszcens jelöléssel.
• Az SSAP ( Sequence Specific Amplification Polymorphism ) [11] az AFLP módszer egy olyan  módosítása volt, amely mind a restrikciós helyen, mind az inszerciónál kimutatja a polimorfizmust.[ tiszta ] egy transzpozon vagy retrotranszpozon genomi DNS-ébe . A vizsgált minták genomiális DNS-ét PstI és MseI restrikciós enzimekkel hasítjuk , és kiálló 3'-végű fragmentumokat kapunk. A korlátozott DNS-t ezután a PstI és MseI adapterekhez ligáljuk . Az első polimeráz láncreakciót (előamplifikációt) a PstI és MseI adapterekből származó primerekkel hajtjuk végre , azaz ezeknek az adaptereknek a korlátozott genomiális DNS-ben lévő összes lehetséges kombinációját amplifikáljuk. Az első PCR után a primerek és az adapterek között lokalizált DNS-fragmensekből nagyszámú amplifikációs termék képződik. A PCR-termékeket hígítjuk, és egy második, szelektív PCR-hez használjuk fel. A második PCR-t a jelölt LTR primerrel és bármely adapter primerrel végezzük, akár PstI -vel, akár MseI -vel . A második PCR primereket használhat az adapterhez további nukleotidokkal a 3' végén, például egy, két vagy három nukleotiddal, amelyek nem komplementerek az adapterrel. A második PCR után az elektroforézist poliakrilamid gélben vagy szekvenáló berendezésben végezzük, ha fluoreszcens jelölést használtunk. Az amplifikációs termékek a második PCR után a retrotranszpozon LTR szekvenciája és az adapter közötti DNS-fragmens amplifikációja eredményeként jönnek létre. Az amplifikációs termékek kinyerése csak LTR szekvenciák között alapvetően lehetséges, de általában a két retrotranszpozon közötti távolság nagyobb, mint az általában kapott PCR-termékek mérete (2500-3000 bázispár). És az adapterek közötti amplifikációs termékek nem észlelhetők, mivel csak az LTR primer címkéjét használják.
• Az IRAP archív másolata 2016. október  30-án, a Wayback Machine -nél  ( Inter Retrotransposone Amplified Polymorphism ) [12] [13]  egy polimeráz láncreakció két szomszédos retrotranszpozon LTR szekvenciájával komplementer primerek között . A módszernek több lehetősége is van. Az IRAP első verziója az LTR egyetlen primerjét használja. Az amplifikációs termékek két, azonos szekvenciájú fordított LTR között képződnek, azaz az egyik szálban az egyik LTR 5' vége a másik LTR 3' vége felé orientálódik. Ha a retrotranszpozon központi része hosszabb, mint a PCR termékek szokásos mérete (kb. 3000 bázispár), akkor a PCR csak két különböző retrotranszpozícióból származó LTR között fut. Ebben az esetben a szomszédos LTR-eket meg kell fordítani. Az IRAP egy másik változata két különböző primert használ az invertált LTR-ekhez: az egyik primer az LTR 5' végén, a másik pedig a 3' végén, a retrotranszpozontól távolodva. Ebben az esetben a szomszédos LTR-ek közvetlen hosszú ismétlődésként vannak elrendezve. És végül, az IRAP harmadik verziójában különböző retrotrapozonokból származó LTR primereket használnak különböző orientációban. Az LTR-ből származó primereket kombinálhatja más, ismétlődő DNS-ből származó primerekkel.
• A REMAP ( Retrotransposone  Microsatellite Amplified Polymorphism ) [12] [13]  egy polimeráz láncreakció egy retrotranszpozon LTR fragmentumának primerje és egy közeli, egyszerű mikroszatellit ismétlődésből származó primer (ISSR primer) között. Ebben az esetben az amplifikált retrotranszpozon fragmens helyzetét egy primer használatával "rögzítjük" a mikroszatellit lókuszhoz. Például növényekben célszerű egy LTR primert és egy mikroszatellit primert (5'- CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA G ) használni, egyetlen szelektív nukleotiddal a primer 3' végén. A REMAP LTR primer variánsokat használ az LTR 5' és 3' végén is, mint az IRAP esetében.
• Az RBIP ( Retrotransposon -Based  Insertion Polymorphisms ) [14]  egy olyan módszer, amely primerek retrotranszpozon szekvenciákhoz való felhasználásán és kodomináns allélváltozatok feltárásán alapul. Elve a többlókuszos PCR-en alapul, amely a DNS-régiót szegélyező primerpárt használ a retrotranszpozíció előtt, és egy primert a retrotranszpozon LTR - jéhez, amelyet ebbe a régióba inszertálnak az első két primer közé. A PCR eredményeként a primerpárral szegélyezett fragmensek egyik variánsa amplifikálódik, mivel az LTR-ek közötti szekvencia túl hosszú ahhoz, hogy a genomiális DNS-helyek között retrotranszpozont tartalmazó PCR-t lehessen végezni. Ez a módszer csak egy adott polimorf lókuszra mutat ki polimorfizmust. Előnyei közé tartozik a polimorf változatok kodominanciája, a nagyszámú fajta felhasználásának lehetősége dot-blot analízishez.
• Az iPBS ( inter PBS amplifikáció ) [15]  egy olyan módszer, amely a PBS (primer kötőhely ) retrotranszpozon szekvenciák primereinek használatán alapul .  A módszer hatékony a minták közötti polimorfizmus kimutatására, valamint új retrotranszpozonok klónozására eukariótákban . 
• Egy nukleotid polimorfizmus (SNP).

Jegyzetek

1. ↑ Southern EM Specifikus szekvenciák kimutatása gélelektroforézissel elválasztott DNS-fragmensek között  // J  Mol Biol : folyóirat. - 1974. - 1. évf. 98 , sz. 3 . - P. 503-517 . - doi : 10.1016/S0022-2836(75)80083-0 .
2. ↑ Jeffreys AJ, Wilson V., Thein SW Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA   // Nature . - 1984. - 1. évf. 314 . - 67-73 . o . - doi : 10.1038/314067a0 .
3. ↑ Kalendar R. A retrotranszpozon alapú molekuláris markerek használata a genetikai sokféleség elemzéséhez  //  Field and Vegetable Crops Research: Journal. - 2011. - 20. évf. 48 , sz. 2 . - P. 261-274 . - doi : 10.5937/ratpov1102261K .
4. ↑ Kalendar R., Flavell A., Ellis THN, Sjakste T., Moisy C., Schulman AH Analysis of plant diversity with retrotransposon-based molecular marker  //  Heredity : Journal. - 2011. - 20. évf. 106 . - P. 520-530 . - doi : 10.1038/hdy.2010.93 .
5. ↑ Naptár R.N., Glazko V.I. A molekuláris genetikai markerek típusai és alkalmazása  // A kultúrnövények fiziológiája és biokémiája: folyóirat. - 2002. - T. 34 , 4. sz . - S. 141-156 .  (Orosz) (nem elérhető link)
6. ↑ Williams JG, Kubelik AR, Livak KJ, Rafalski JA, Tingey SV Tetszőleges primerekkel amplifikált DNS-polimorfizmusok hasznosak genetikai markerként  //  Nucleic Acids Research : folyóirat. - 1990. - 1. évf. 18 , sz. 22 . - P. 6531-6535 . doi : 10.1093 / nar/18.22.6531 .
7. ↑ Welsh J., McClelland M. Genomok ujjlenyomata PCR segítségével tetszőleges primerekkel  //  Nucleic Acids Research : folyóirat. - 1990. - 1. évf. 18 . - P. 7213-7218 . doi : 10.1093 / nar/18.24.7213 .
8. ↑ Sivolap Yu.M., Calendar R.N., Chebotar S.V. Gabonanövények genetikai polimorfizmusa PCR segítségével tetszőleges primerekkel  // Tsitol Genet. : folyóirat. - 1994. - T. 28 . - S. 54-61 . (Orosz)
9. ↑ Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR ) -anchored polymerase chain response amplification   // Genomics  : Journal. - Akadémiai Kiadó , 1994. - 1. évf. 20 , sz. 2 . - 176-183 . o . doi : 10.1006/ geno.1994.1151 .
10. ↑ Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., van de Lee T., Hornes M., Frijters A., Pot J., Peleman J., Kuiper M. et al. AFLP: a DNS ujjlenyomatának új technikája  //  Nucleic Acids Research : folyóirat. - 1995. - 1. évf. 23 . - P. 4407-4414 . doi : 10.1093 / nar/23.21.4407 .
11. ↑ Waugh R., McLean K., Flavell AJ, Pearce SR, Kumar A., ​​Thomas BB, Powell W. A Bare-1-like retrotranszponálható elemek genetikai eloszlása ​​az árpa genomjában, amelyet szekvencia-specifikus amplifikációs polimorfizmusok fedeztek fel (S) -SAP )  (angol)  // Molecular General Genetics: Journal. - 1997. - 1. évf. 253. sz . 6 . - P. 687-694 . - doi : 10.1007/s004380050372 .
12. ↑ 1 2 Kalendar R., Grob T., Regina M., Suoniemi A., Schulman AH IRAP és REMAP: Két új retrotranszpozon-alapú DNS ujjlenyomat-technika   // Elméleti és alkalmazott genetika : folyóirat. - 1999. - 1. évf. 98 . - P. 704-711 . - doi : 10.1007/s001220051124 .
13. ↑ 1 2 Kalendar R., Schulman AH IRAP és REMAP retrotranszpozon alapú genotipizáláshoz és ujjlenyomatvételhez   // Nature Protocols : folyóirat. - 2006. - Vol. 1 , sz. 5 . - P. 2478-2484 . - doi : 10.1038/nprot.2006.377 .
14. ↑ Flavell AJ, Knox MR, Pearce SR, Ellis THN. Retrotranszpozon alapú beillesztési polimorfizmusok (RBIP) a nagy áteresztőképességű markeranalízishez  //  The Plant Journal : folyóirat. - 1998. - 1. évf. 16 , sz. 5 . - P. 643-650 . - doi : 10.1046/j.1365-313x.1998.00334.x .
15. ↑ Kalendar R., Antonius K., Smykal P., Schulman AH  iPBS : Univerzális módszer DNS ujjlenyomat-vételre és retrotranszpozon izolálásra  // Elméleti és alkalmazott genetika : folyóirat. - 2010. - 20. évf. 121. sz . 8 . - P. 1419-1430 . - doi : 10.1007/s00122-010-1398-2 .