DNS-üstökös módszer

Az oldal jelenlegi verzióját még nem ellenőrizték tapasztalt közreműködők, és jelentősen eltérhet a 2020. augusztus 22-én felülvizsgált verziótól ; az ellenőrzéshez 1 szerkesztés szükséges . A DNS-üstökösök megjelenése és rangsorolása:
A DNS-üstökösök öt feltételes típusa, amelyeket figyelembe vesznek a DNS-károsodás mértékének elemzésekor

A DNS-üstökös módszer a DNS-károsodás kimutatására és az egyes sejtek szintjén történő javítás tanulmányozására szolgál. A módszer képes kimutatni a DNS-szál töréseket az egyes sejtekben. Gyors és nagyon érzékeny [1] .

Történelem

Rydberg és Johanson (1978) [2] munkáját tekintik az első sikeres tapasztalatnak az egyes sejtek DNS-károsodásának vizsgálatában . Ezt követően a módszert többször módosították és tökéletesítették annak érdekében, hogy egyszerűsítsék és növeljék a sejtes DNS-károsodás észlelésének érzékenységét [2] .

Alkalmazhatóság

A DNS-üstökös módszer in vivo és in vitro rendszerekben egyaránt alkalmazható . Jelenleg a módszert széles körben alkalmazzák az ionizáló sugárzás genotoxicitásának , a gyógyszerek és az ipari vegyszerek, a DNS-javítás, az apoptózis, a prenatális diagnózis, a rákérzékenység, a rákterápia és a szürkehályog klinikai vizsgálataiban. Ez a módszer fokozatosan a biomonitoring programok szerves részévé válik:

az étrend, a környezeti tényezők, az anyagcsere és élettani állapot változásai, a szervezet öregedésének hatásának felmérése a DNS-károsodások felhalmozódására és helyreállítására;
a sugárvédő hatások mechanizmusainak, a radioadaptív válasz kialakulásának tanulmányozására;
környezeti kutatás.

A módszer alkalmazása lehetővé teszi az összetett populációk heterogenitásának figyelembe vételét, a DNS-károsodások és -javítások hozamának tanulmányozását szinte bármely eukarióta sejtben. Ugyanakkor a vizsgálati mintából mindössze néhány ezer sejtre van szükség az elemzéshez [1] [3] .

Módszer nyilatkozat

A vizsgált faktornak kitett sejtek immobilizálását alacsony olvadáspontú agarózban végezzük, amelyet mikroszkópos tárgylemezre helyezünk. A minták magas sótartalmú pufferben történő kezelése a sejtmembránok líziséhez és a fehérjék extrakciójához vezet. A DNS-molekulákat elektroforézissel választják el, a DNS-nyomokat fluoreszcens festékkel való festéssel teszik láthatóvá, majd mikroszkóppal megvizsgálják a mintákat. DNS-törések jelenlétében a kromatin szerkezeti szerveződése megszakad, és a DNS szuperspirálozása megszűnik , ami ennek a biomakromolekulának a relaxációjához vezet, és olyan DNS-fragmensek képződnek, amelyek nem kapcsolódnak a sejthez. Elektromos térben relaxált hurkok és DNS-fragmensek húzódnak az anód felé, ami a megfigyelt objektumoknak "üstökösök" megjelenését kelti (innen ered az általánosan használt " comet assay " elnevezés). Az anód felé vándorló és mikrofotométerrel meghatározott DNS mennyisége indikátorként használható a vizsgált sejtek DNS-károsodásának mértékére. Az „üstökösöket” vagy vizuális megfigyeléssel, és az „üstökösök” DNS-károsodás mértéke szerint történő megkülönböztetésével, vagy számítógépes képfeldolgozó szoftver segítségével elemezzük. Az "üstökösök" utóbbi elemzési módszere különösen szükséges egy kis koncentrációjú károsító szer hatásának objektív értékeléséhez, vagy a sejtalpopulációk közötti kisebb eltérések azonosításához [1] .

Módszer szabványosítás

Jelenleg a legtöbb laboratórium, amely ezt a módszertani megközelítést alkalmazta a kutatásban, a protokoll számos változatát fejlesztette ki, különös tekintettel a sejtlízis időtartamára és körülményeire, a denaturációra, az elektroforézisre és a DNS-festésre. Egy üvegen 25-500 sejtet számolunk meg két párhuzamosban. A kísérlet eredményei megbízhatóak, ha legalább 6-szor megismétlik. A DNS-üstökösök elemzése elvégezhető vizuálisan vagy szoftver- és hardverkomplexum segítségével. A vizuális elemzés során a DNS-üstökösöket öt feltételes típusba sorolják, a megfelelő számértékkel 0 és 4 között.

Indexek számítása

Kijelölés	Jellegzetes	Számítás
${\mathsf {\mbox{I}}}_{{\mbox{dc}}}$	A DNS-üstökös indexe (DNS-üstökös indexe) ${\mathsf {\mbox{I}}}_{{\mbox{dc}}}$ — A DNS károsodás mértéke A DNS-üstökös indexet az egyes típusok "DNS-üstökösei" összegének a megszámlált "DNS -üstökösök" összegéhez viszonyított arányaként számítják ki.	${\mathsf {\mbox{I}}}_{{\mbox{dc}}}={\frac {(0{\mbox{n}}_{0}+1{\mbox{n}}_{ 1}+2{\mbox{n}}_{2}+3{\mbox{n}}_{3}+4{\mbox{n}}_{4})}\Sigma }$ , ahol az egyes típusok „DNS-üstököseinek” száma, és ${\mbox{n}_0 - \mbox{n}_4}$ ${\Sigma}$ - a megszámolt „DNS-üstökösök” összege.

Képalkotó és elemző programok

A CometScore egy ingyenes program a DNS-üstökös pontszámok félautomata kiszámításához, kompatibilis a Windows 5 és 6 rendszerrel.
CaspLab – GPL szoftver.
Kereskedelmi program – a Comet Assay Interest Group listája

Lásd még

Jegyzetek

↑ 1 2 3 Sorochinskaya, Mikhailenko, 2008 , p. 303-309.
↑ 1 2 Rydberg B, Johanson KJ. DNS-száltörések becslése egyetlen emlős sejtben // Academic Press. - New York, 1978. - S. 465-468 .
↑ S. Cotelle és JF Ferard. Comet Assay in Genetic Ecotoxicology: A Review // Environmental and Molecular Mutagenesis. - Wiley-Liss, 1999. - T. 34 . - S.: 246-25 . Az eredetiből archiválva: 2016. március 4.

Irodalom

A káros környezeti tényezőknek való hosszú távú kitettség a DNS-károsodás felhalmozódásával és a javítórendszer aktivitásának megváltozásával jár, ami mutációkhoz és a sejt rosszindulatú átalakulásához vezethet. Az elmúlt években számos módszert fejlesztettek ki a DNS-károsodás kimutatására és a javítási folyamatok tanulmányozására. Azonban nem mindegyik rendelkezik azzal az érzékenységgel és specifitással, amely a DNS környezeti károsodásának széles körének nyomon követéséhez szükséges. Az áttekintés célja a lizált egysejtek gélelektroforézisének módszere (DNS-üstökös módszer) hatékonyságának értékelése a különböző környezeti tényezők által okozott DNS-károsodások kimutatására. A módszer rendelkezik azzal az érzékenységgel, amely szükséges a DNS-károsodás és -javítás egy egyedi sejt szintjén történő kimutatásához, és felhasználható a genom integritásának felmérésére.
W.B. Sorochinska, V.M. Mihajenko. A DNS-üstökös módszer alkalmazása különböző környezeti tényezők által okozott DNS-károsodás felmérésére // ONKOLÓGIA : Cikk. - Kijev, 2008. - T. 10 , sz. 3 . - S. 303-309 . Az eredetiből archiválva: 2016. március 5. (Orosz)
Avishai, Nanthawan; Rabinowitz, Claudette; Moiseeva, Elisabeth & Rinkevich, Baruch. A Kishon folyó genotoxicitása: in vitro celluláris assay alkalmazása: HTML absztrakt. - Israel: Mutation Research, 2002. - 1. kötet , 1. sz. 518 . – S. 21–37 . - doi : 10.1016/S1383-5718(02)00069-4 .
Collins, A. R.; Dobson, VL; Dusinska, M.; Kennedy, G. & Stetina, R. Az üstökösvizsgálat: mit tud valójában mondani? // Mutációkutatás : HTML absztrakt. - 1997. - 2. kötet , szám. 375 . - S. 183-193 . - doi : 10.1016/S0027-5107(97)00013-4 .
Claude, M.; Erikson, S.; Nygren, J. & Ahnstrom, G. Az üstökösvizsgálat: mechanizmusok és technikai megfontolások. - Mutation Research, 1996. - Vol. 2 , no. 363 . - S. 89-96 . - doi : 10.1016/0921-8777(95)00063-1 .
McKelvey-Martin, Valerie J.; Ho, Edwin T.; McKeown, Stephanie R.; Johnston, S. Robin; McCarthy, Patsy J.; Rajab, Nor Fasilah & Downes, C. Stephen. Az egysejtű gélelektroforézis (Üstökös) vizsgálat újszerű alkalmazásai. I. Invazív átmeneti sejtes humán hólyagkarcinóma kezelése. II. Fluoreszcens in situ hibridizáció Üstökösök a sérült és javított DNS-szekvenciák azonosítására egyedi sejtekben : PDF fulltext. - Mutagenezis, 1993. - T. 1 , 1. sz. 13 . - S. 1-8 . - doi : 10.1016/0921-8777(95)00063-1 .
Olive, P. L.; Wlodek, D. & Banath, JP gélelektroforézisnek alávetett egyedi sejtekben mért DNS kettős szálú törések // Cancer Research : PDF fulltext. - 1991. - T. 17 , sz. 51 . - S. 4671-4676 .
Rojas, E.; Lopez, MC & Valverde, M. Egysejtű gélelektroforézis: módszertan és alkalmazások // Journal of Chromatography B : HTML abstract. - 1999. - T. 722 (1-2) . - S. 225-254 . - doi : 10.1016/S0378-4347(98)00313-2 .
Singh, N. P.; McCoy, M. T.; Tice, RR & Schneider, EL Egyszerű technika az alacsony szintű DNS-károsodás mennyiségi meghatározására az egyes sejtekben // Experimental Cell Research. - 1988. - T. 175 (1) . - S. 184-191 . - doi : 10.1016/0014-4827(88)90265-0 .