Az ion félvezető szekvenálás ( eng. Ion Semiconductor Sequencing ) a DNS szekvencia meghatározására szolgáló módszer , amely a DNS polimerizáció során felszabaduló hidrogénionok kimutatásán alapul . Ez egy "szintézis szekvenálása" technika, amelyben egy komplementer szálat állítanak elő egy templátszál szekvenciájából.
A szekvenálandó templát DNS-molekulát tartalmazó mikroüregekbe egyfajta dezoxiribonukleotid-trifoszfátot (dNTP) töltünk. Ha a bejuttatott dNTP komplementer a templát vezető nukleotidjával, akkor a növekvő komplementer szálban szerepel. Ez hidrogénionok felszabadulását okozza, ami elindítja az ISFET ionérzékelőt , amely azt jelzi, hogy reakció lejátszódott. Ha egy nukleotid ismétlődése van jelen a templátlánc szekvenciájában, akkor egy ciklusban több dNTP molekula kapcsolódik. Ez a képződött hidrogénionok számának növekedéséhez és ezzel arányosan magasabb elektromos jelhez vezet.
Ez a technológia abban különbözik a többi szekvenálási technológiától , hogy nem használ módosított nukleotidokat és optikai érzékelőket. Az ion-félvezető-szekvenálást ionáram-szekvenálásnak, pH-közvetített szekvenálásnak vagy félvezető-szekvenálásnak is nevezhetjük. Az Ion Torrent Systems, Inc. által kifejlesztett technológiát a DNA Electronics Ltd., [1] [2] engedélyezte , és 2010 februárjában adták ki. [3] Az Ion Torrent olyan gyors, kompakt és gazdaságos szekvenszereket pozícionált, amelyek számos laboratórium számára alkalmasak, mint professzionális rendszerek. [4] A Roche 454 Life Sciences együttműködik a DNA Electronics-szal, hogy ezzel a technológiával egy kompakt, hosszú szekvenciát leolvasó DNS-platformot fejlesszenek ki. [5]
A dezoxiribonukleotid - trifoszfát (dNTP) beépülése a növekvő DNS-láncba kovalens kötés kialakulásával, valamint pirofoszfát és pozitív töltésű hidrogénion felszabadulásával történik. [1] [3] [6] A dNTP csak akkor kerül bele, ha komplementer a templátszál vezető párosítatlan nukleotidjával. Az ion-félvezető szekvenálás azon a tényen alapul, hogy amikor az egyik típusú dNTP-t egy másikkal helyettesítjük, hidrogénion szabadul fel.
A módosítatlan A, C, G vagy T dNTP -ket szekvenciálisan minden mikrolyukba töltik egy félvezető chipen , amely egy szekvenálandó egyszálú DNS-templátmolekulát és DNS-polimerázt tartalmaz . [3] [7] [8] Ha a bejuttatott dNTP komplementer a következő párosítatlan nukleotiddal a templátszálon, akkor a DNS-polimeráz beépíti a növekvő komplementer szálba. [9] Ha a bevezetett dNTP nem komplementer, a polimerizációs reakció nem megy végbe. A reakció során felszabaduló hidrogénion megváltoztatja az oldat pH -ját , amit az ISFET érzékel . [1] [3] [7] A reagálatlan dNTP-molekulákat a következő ciklus előtt kimossák, amikor más dNTP-fajtákat visznek be. [7]
Az ISFET érzékelők a mikrolyukak ionérzékeny rétege alatt helyezkednek el . [4] Minden réteg egy CMOS chipen van elhelyezve, hasonlóan az elektronikai iparban széles körben használtakhoz. [4] [10]
Mindegyik chip mikrolyukak sorát tartalmazza a megfelelő ISFET érzékelőkkel. [7] Minden egyes kibocsátott hidrogénion kiváltja az ISFET érzékelőt. A chipről a számítógépre továbbított elektromos impulzusok sorozata DNS-szekvenciává alakul át közbenső jelátalakítás nélkül, [7] [11] mivel az elektronika közvetlenül regisztrálja a láncban a nukleotidzárványok eseményeit, jelölt nukleotidok és optikai eszközök használata nélkül. mérések. [4] [10] A jelfeldolgozás és a DNS-szekvencia összeállítás szoftveresen is elvégezhető.
Az ion-félvezető szekvenálás pontossága 2011 februárjában 99,6% volt egy 50 nukleotidból álló fragmenssel (olvasva), 100 Mb lépésenként. [12] 2011 februárjában a szekvenált fragmentumok hossza 100 bázispár volt. [12] Az 5 nukleotid hosszúságú ismétlődések leolvasásának pontossága 98% volt. [12] Ezeket az adatokat a vállalaton kívül még nem ellenőrizték független módon.
Az ion-félvezető szekvenálás fő előnyei a nagy szekvenálási sebesség alacsony kezdeti beruházási és üzemeltetési költségek mellett. [8] [11] Ezt a módosított nukleotidok és az optikai mérések hiánya tette lehetővé.
Mivel a rendszer rögzíti a természetes polimeráz által végzett nukleotid-addíciók eseményeit, a szekvenálás valós időben történhet. Valójában a szekvenálás sebességét a nukleotid szubsztrát változási sebessége korlátozza . [13] A technológiát kifejlesztő Ion Torrent Systems azt állítja, hogy minden egyes nukleotid hozzáadása mérése (rögzítése) 4 másodpercig tart, és egy-egy futtatás körülbelül egy óráig tart, amely során egy 100-200 nukleotidból álló szekvenciát szekvenálnak. [11] [14] A félvezető chipek terén elért haladás ( a Moore-törvény előrejelzése szerint ) azt sugallja, hogy a chipenkénti (és így futásonkénti) leolvasások számának növekednie kell. [tizenegy]
Az Ion Torrent Systems, Inc. pH-közvetített szekvenszerének beszerzési költsége az induláskor körülbelül 50 000 dollár volt, nem tartalmazza a minta-előkészítő berendezést és az adatelemző szervert. [8] [11] [14] A futtatásonkénti költség is jelentősen alacsonyabb, mint az alternatív automatizált szekvenálási módszerek, körülbelül 1000 dollár. [8] [12]
Ha a (szekvenálandó) templátszálon ugyanazon nukleotid ismétlődéseiből álló homopolimer (pl. GGGGG) van jelen, akkor egyszerre több nukleotid kapcsolódik, és egy ciklus alatt több hidrogénion képződik. Ez nagyobb pH-változást és ezzel arányosan magasabb elektronikus jelet eredményez. [11] Ennek a rendszernek az a korlátja, hogy nehéz kiszámítani az ismétlés hosszát. Ezt a korlátozást más módszerek is megosztják, amelyek egyetlen nukleotid inszerciót észlelnek, például a piroszekvenálás . [15] A hosszú ismétlődés által generált jeleket nehéz megkülönböztetni a hasonló, más hosszúságú jelektől, például egy 7 nukleotid hosszú ismétlődést nehéz megkülönböztetni a 8 nukleotid hosszú homo ismétlődéstől.
Szignifikáns szekvenálási hibák is előfordultak egyetlen nukleotid inszerció és deléció formájában, általában heterozigóta állapotban. A probléma megoldása érdekében a Life Technologies frissítést adott ki az Ion Reporter szoftvertermékhez.
Ennek a rendszernek egy másik hátránya a rövid olvasási hossz más szekvenálási módszerekkel összehasonlítva, mint például a Sanger-szekvenálás vagy a piroszekvenálás . A nagy leolvasott fragmentumok hasznosak a de novo genom összeállításhoz . A mai napig az Ion Torrent Systems, Inc. által elért olvasási hossz menetenként 600 bázispár . [3] [8] Jelenleg az áteresztőképesség alacsonyabb, mint más nagy áteresztőképességű szekvenálási technológiáké, bár a fejlesztők azt remélik, hogy ezen változtatni tudnak a chipenkénti mikrolyukak sűrűségének növelésével . [3] 2018-ban megjelent az Ion GeneStudio S5 szekvenátorok új sorozata, amely teljesítményében összehasonlítható más teljes genom szekvenálási technológiákkal, miközben sebességében felülmúlja azokat.
Az ion félvezető szekvenáló gyors, kompakt és gazdaságos szekvenáló gépként pozicionálódik a piacon, amely számos laboratóriumban használható csúcskategóriás gépként. [3] [4] A cég azt reméli, hogy rendszerüket nemcsak szakközpontokban, hanem kórházakban, kis egyetemi és ipari laboratóriumokban is alkalmazni fogják. A New York Times 2011. januári cikke, „A DNS-szekvenálás a tömegekbe vitelével” kiemeli ezt a törekvést. [16]
Mivel az alternatív szekvenálási módszerek képesek hosszabb olvasási hossz elérésére (és ezért alkalmasabbak a teljes genom elemzésére ), ez a technológia lehet a legalkalmasabb kis léptékű alkalmazásokhoz, mint például mikrobiális genom szekvenálás, mikrobiális transzkriptom szekvenálás, célszekvenálás, amplikon szekvenálás vagy a könyvtári sorrend minőségi ellenőrzésére. [3] [8]