A ligálásmentes klónozás ( LIC , Ligation Independent Cloning ) a génsebészetben olyan plazmidok előállítására szolgáló módszer, amely nem alkalmaz restrikciós és ligációs reakciókat.
A ligázmentes klónozás technológiája csökkenti az új genetikai konstrukciók létrehozásának idejét, például egy rekombináns fehérje expressziójához , és a legjobban alkalmas nagy áteresztőképességű fehérjegyártó vonalhoz. A ligálásmentes klónozáshoz LIC vektort kell készíteni – egy linearizált DNS-szekvenciát specifikus, 11-14 nukleotid hosszúságú ragadós végekkel . Ehhez a vektormolekulát az egyik helyen restrikciós enzimmel hidrolizálják , majd az egyik nukleotid jelenlétében T4 fág DNS polimerázzal kezelik. Ennek az enzimnek a 3'-exonukleáz aktivitásaa nukleotidok eltávolításához vezet a 3'-végről, amíg a reakcióelegyben lévő nukleotidot meg nem találjuk a szekvenciában (lásd az ábrát). A vektormolekula speciálisan úgy van elkészítve, hogy ez a nukleotid 11-14 egységig ne forduljon elő a restrikciós hely mindkét oldalán. Miután egy LIC vektort izoláltunk, tárolható és újra felhasználható a célfehérje gének klónozására. E gének PCR -láncindítóit úgy választjuk meg, hogy egyrészt komplementerek legyenek a célgén kezdetével vagy végével, másrészt a LIC vektor ragadós régióival. Ezután PCR után fehérjegént kapunk, amelyben mindkét oldalon 11-14 nukleotid hosszúságú, a vektorral komplementer egyszálú szekvenciák találhatók . Elegendő egy ilyen terméket összekeverni egy vektorral, és a keverékkel kompetens bakteriális sejteket transzformálni, hogy fehérjegént tartalmazó plazmidokat kapjunk. Így a ligálás nélküli klónozás elkerüli a restrikciós, gélesedési és ligálási több lépést, amelyek mindegyike klónozási kudarcot okozhat.
1. De Jong, R. Enzyme Free Cloning for high performance gene klónozás és expresszió / R. de Jong, M. Daniels, R. Kaptein és G. Folkers // J. Struct. Funkció. Genomika. - 2006. - V. 7. - P. 109–118.
2. Lee, J. Nagy áteresztőképességű T7 LIC vektor változó hosszúságú C-terminális polihisztidin címkék bejuttatására extra szekvenciák nélkül / J. Lee és S. Kim // Prot. Expr. Purif. - 2009. - V. 63. - P. 58–61.
3. Novy, R. Ligation Independent Cloning: Efficient Directional Cloning of PCR Products / R. Novy, K. Yaeger és K. Kolb // Innovations. - 1997. - V. 5. - P. 1-3.
4. Bardóczy, V. A ligációtól független in vitro transzlációs vektorok készlete eukarióta fehérjetermeléshez / V. Bardóczy, V. Géczi, T. Sawasaki, Y. Endo és T. Mészáros // BMC Biotechnology. - 2008. - V. 8. - 32. szám - P. 1-7.